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2D电泳技术:双向电泳操作步骤及相关溶液配置
作者: 来源: 2014-06-18

A. 实验过程
一 实验原理:
    2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离.这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息.
二 实验步骤:
1. 样品的溶解
    取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时.其中每隔10~15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,—80oC保存.
2. Bradford法测蛋白含量
    取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量.取 7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的 Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品 OD值.(测量过程要在一个小时内完成).
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)
3.1 水化液的制备
    称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清.在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清.
3.2 点样,上胶
    分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3—10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品.注意:胶条使用前,要在室温中平衡30分钟;加样时,正极要多加样,以防气泡的产生;压胶时不能产生气泡;酸性端对应正极,碱性端对应负极;样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平.
3.3  IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20℃)
       S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
       S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
       S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
       S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
       S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时
    其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
    用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后,在滤纸上吸干(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸,如果为18cm的胶条要将两头剪去),再以超纯水冲洗,滤纸吸干(再次冲洗过程也可省略),然后用镊子夹住胶条以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上,放入用来平衡的试管中(镊子所夹的是碱性端,酸性端留有溴 酚兰作为标记),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min.  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁.
    平衡第二次时,在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片,长度与一向胶条的宽度等同,然后吸取煮好的Marker,转入SDS—PAGE胶面上,保持紧密贴合;同样在第二次平衡时,煮5%的琼脂糖10ml.4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE 
4.1 配胶(两根胶条所用剂量)
      分离胶:(T=8%  80 ml):溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED
      30 % 丙烯酰胺储液    21.28ml
      分离胶buffer           20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul
      双蒸水                   38.72ml 
      浓缩胶:(T=4.8%   10ml)
      30 % 丙烯酰胺储液     1.6ml
      浓缩胶buffer            2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul
      双蒸水                   5.9ml
4.2 灌胶
      将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保鲜膜封好.
4.3 转移
      剪两个小的滤纸片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE胶面的一端.然后,将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面 上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶 面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡.
4.4 跑胶
     浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时
5. 银染(两根胶条所用剂量)(银染特别注意用超纯水)
5.1  固定   30min    无水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超纯水定容至500ml
5.2  敏化   30min    无水乙醇 150ml
                         Na2S2O3•5H2O  1.5688g
                         无水乙酸钠          34g  
                         先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3  洗涤   5min  ×  3次
5.4  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml
5.5  洗涤   1min  ×  2次
5.6  显影             无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml
                       甲醛(37%)0.1ml, 临时加
5.7  终止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml
5.8  洗涤   5min  ×  3次
    注:整个双向电泳实验中全部使用超纯水,尽量减少离子的影响.
B实验相关试剂配制
1.Bradford 工作液
95%乙醇             25ml       先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷
85%磷酸             52ml       酸,最后超纯水定容至500ml.过滤后置于棕色瓶
考马斯亮兰G250   0.035g     外加油皮纸保存(Bradford不稳定,一周内有效) 
2.裂解液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS             4%
DTT                 60 mM
Tris—base          40 mM(如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate)
3. 水化液储液
尿素                 8M 
硫脲                 2M
CHAPS             4%
Tris—base          40 mM
4. 分离胶buffer (pH8.8)                         250ml
SDS                  0.4%                   1g
Tris—HCl           1.5M                 45.4275g
5. 浓缩胶buffer (pH6.8)                         100ml
SDS                  0.4%                  0.4g
Tris—HCl           0.5M                  6.07g
6.凝胶储存液(30%的丙烯酰胺)               250ml
Acr                  29.2%                  73g
Bis                   0.8%                   2g
7. 电极缓冲液(跑一次要配制2500ml)
甘氨酸             43.2g                   36g
Tris                  9g         或           7.5g
SDS                 3g                      2.5g                
超纯水定容至3000ml                    超纯水定容至2500ml
8.0.5M Tris —HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解,再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml
9.平衡液储液
脲(即尿素)         36g
甘油                    30%                  30ml
SDS                    1%                   1g
0.5M Tris—HCl pH6.8  10ml              超纯水定容至100ml
10. 平衡液A(一根胶条)
DTT                   20mg
平衡液储液           10ml
11.平衡液B(一根胶条)
碘乙酰氨             300mg
平衡液储液           10ml
0.05%溴酚兰          15ul              (平衡液A、B均需临时配制)
12.0.5%琼脂糖10ml
琼脂糖                0.05g
电极缓冲液           10ml
溴酚兰                25ul
补:4、5、6的溶液需过滤后储存于4℃备用.