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RT-PCR步骤
作者: 来源: 2014-03-11

  

 

  总RNA提取

  1. 取200mg组织,放到1.5ml EP管中,加入1ml Trizol剪碎。

  2. 震荡30s。

  3. 加0.2ml氯仿,剧烈摇动30s,室温3min。

  4. 12000×g,4℃离心,15min。

  5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中(约0.5ml)。

  6. 加等体积异丙醇,-20℃,30min。

  7. 12000×g,4℃离心,10min。在管底部可见微量RNA沉淀

  8. 弃上清,加75%乙醇1ml,振荡。

  9. 7500×g,4℃离心,10min。

  10. 弃上清,用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5-10min。

  11. 沉淀溶于20μl DEPC水,取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280

  12. 计算浓度与纯度,-70℃保存。

  OD260×40×稀释倍数

  RNA浓度(μg/μl)=────────────

  1000

  逆转录合成 cDNA

  反应体系如下

  ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

  MgCl2 2μl

  10×RT Buffer 1μl

  RNase Free dH2O 3.75μl

  dNTP Mixture(各10mM) 1μl

  RNase Inhibitor 0.25μl

  AMV Reverse Transcriptase 0.5μl

  Random 9 mers 0.5μl

  Positive Control RNA (1μg) 1μl

  混匀快速离心一次

  反应条件如下

  30℃ 10min

  42℃ 30min

  99℃ 5min

  5℃ 5min

  -20℃ 冰箱冻存

  PCR反应

  ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

  摸板cDNA 2.5μl

  5×PCR Buffer 2.5μl

  灭菌蒸馏水 7.2μl

  聚合酶 Ex TaqHS 0.1μl

  上游引物 0.1μl

  下游引物 0.1μl

  ─────────────────────────────

  Total 12.5μl

  混匀快速离心一次

  反应条件

  94℃ 2min 1Cycle

  94℃ 40sec ┓

  50-65℃ 40sec ┃ 25-35Cycles

  72℃ 1min ┛

  72℃ 5min 1Cycle

  PCR产物-20℃冰箱保存

  取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V

  100mA 30min 溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果