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PCR技术:PCR技术概论
作者: 来源: 2014-04-14

 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑. 

一、PCR技术简史:
 
1、PCR的最早设想: 
    核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:"经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因".
2、PCR的实现:
 
    1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应.其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件:模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间.
3、PCR的改进与完善:
 
    Mullis最初使用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加.②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之 间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一.此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于 Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难.这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视.1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段.但每循环一次,仍需加入新酶.1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶.此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%.②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶.③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率,增加了扩增长度(2.0Kb).由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高.为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶 (Taq DNA Polymerase).此酶的发现使PCR广泛的被应用.

二、PCR技术基本原理:
 
1、PCR技术的基本原理 

    类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引 物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 2-4分钟,2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.

2、PCR的反应动力学  
    PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%, 但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现"停滞效应",这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.
3、PCR扩增产物
  
    可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3'端则没有固定的止点,长短不一,这就是"长产物片段".进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即"长产物片段")结合.引物在与新链结合 时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的"短产物片段".不难看出"短产物片段"是按指数倍数增加,而"长产物片段"则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计, 这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用. 

三、PCR反应体系与反应条件:

1、标准的PCR反应体系:
   10×扩增缓冲液   10ul
   4种dNTP混合物      各200umol/L
   引物         各10~100pmol 
   模板DNA         0.1~2ug 
    Taq DNA聚合酶   2.5u 
   Mg2+       1.5mmol/L
   加双或三蒸水至  100ul
2、PCR反应五要素:
 
    参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
3、引物
 
    引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.
    设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右.
②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.

4、引物量: 
    每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.
5、酶及其浓度: 

    目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少.
6、dNTP的质量与浓度: 
    dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低.
模板(靶基因)核酸:
    模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本. SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接 用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
7、Mg2+浓度:
    Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜.Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少.

四、PCR反应条件的选择:
    PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
1、温度与时间的设置:
 
    基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
①变性温度与时间:
    变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则 需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
②退火(复性)温度与时间:
    退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长 度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
     Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
     复性温度=Tm值-(5~10℃)
  在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合.

③延伸温度与时间:
    Taq DNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃   150核苷酸/S/酶分子
70℃       60核苷酸/S/酶分子
55℃       24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.、
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.
2、循环次数:
    循环次数决定PCR扩增程度.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多.
 

五、PCR反应特点:
 
1、特异性强:

PCR反应的特异性决定因素为:
  ①引物与模板DNA特异正确的结合;
  ②碱基配对原则;
  ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
  ④靶基因的特异性与保守性.
  其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高.
2、灵敏度高:

    PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌.
3、简便、快速:
    PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4小时完成扩增反应.扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广.
4、对标本的纯度要求低:
    不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板.可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测.

六、PCR扩增产物分析: 
    PCR产物是否为特异性扩增 ,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论.PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法.
1、凝胶电泳分析:
    PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性.PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件.
2、琼脂糖凝胶电泳: 
    通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用.
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
    6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析.
3、酶切分析:
    根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究.
4、分子杂交:
    分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法.
5、Southern印迹杂交 
    在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研.
6、斑点杂交: 
    将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析.
7、核酸序列分析:
    是检测PCR产物特异性的最可靠方法.