您现在在位置: » 内容
DNA提取与纯化:外周血DNA提取技术
作者: 来源: 2014-03-21

  

 

  方法一:

  1. 标本预处理:将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中,加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS),混匀,3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清.重复一次.用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀,37℃水浴温育1h.

  2. 消化:上述DNA提取液混悬白细胞,37℃水浴温育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀,液体变粘稠.50℃水浴保温3h,裂解细胞,消化蛋白.保温过程中,应不时上下转动几次,混匀反应液.

  3. 酚抽提纯化DNA:上述反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚溶液,温和地上下转动离心管5-10min,直至水相与酚相混匀成乳状液.5000g离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中.重复酚抽提一次.加等体积的氯仿:异戊醇(24﹕1),上下转动混匀,5000g离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中.重复一次.

  4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇,室温下慢慢摇动离心管,即有乳白色云絮状DNA出现.用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA,转入另一1.5 ml离心管中,加70%乙醇0.2ml,5000g离心5min洗涤DNA,弃上清,去除残留的盐.重复一次.室温挥发残留的乙醇,但不要让DNA完全干燥.加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动,DNA完全溶解通常需12-24小时.

  5. DNA的浓度测定及纯度判定:取DNA溶液用TE液做适量稀释,以TE液作空白对照,在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值.

  按下面公式计算浓度: DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000

  DNA纯度的判定: A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间.

  方法二:

  分别采集外周静脉血5ml,2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶).

  采用NaI提取法提取外周血白细胞基因组.

  (1)取外周抗凝血(全血)100ul于Ep管中,12000rpm离心12min

  (2)弃上清,加双蒸水200ul溶解,摇匀20s

  (3)混匀后加6M NaI溶液200ul,摇匀20s

  (4)加氯仿/异戊醇(24:1)400ul,即加即摇,摇匀20s,12000rpm离心12min.

  (5)取上层液350ul,加入另一新Ep管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm离心12min,使沉淀紧贴Ep管壁.

  (6)弃异丙醇,加70%乙醇1ml(不振动),15000rpm离心12min.

  (7)弃乙醇,敞开Ep管盖, 烘干(37℃恒温箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存备用.

  相关阅读:

  石蜡DNA提取

  DNA片段回收与纯化

  基因组DNA提取方法

  大白鼠肝DNA的提取与鉴定

  MinElute DNA纯化技术