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原创|简析金属螯合亲和层析的应用进展
作者:刘为涛 来源:汇研生物 2017-05-19

 

摘要:

固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离。标签蛋白纯化、高效、经济、简单,所以将标签与蛋白融合表达在科研工作中被广泛应用。由于His标签分子量小、不影响目标蛋白的结构和功能且能在变性条件下进行纯化,是目前分离纯化生物工程蛋白质产品最有效的工具之一。

 

固定化金属螯合亲和层析在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)与蛋白结合力强、容量大,可用于工业生产;(2)洗脱条件温和,纯化过程不会改变靶蛋白的功能活性;(3)使用寿命长,通过清洗-再生可以长期反复使用;(4)选择性多,根据实际情况筛选最适宜的分离纯化条件(选择不同的纯化介质或螯合不同的过渡金属离子)。

应用现状

     固定化金属螯合亲和层析(MCAC)适用于某些蛋白质、酶、氨基酸及肽的分离纯化以及可逆螯合金属离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离纯化。

    

1.用于分离纯化His标签蛋白

       His标签蛋白与其他杂质蛋白质相比,对金属离子有更高的特异性,在分离纯化后再用化学法或酶法将标签切掉,从而得到目标蛋白。

 

2.用于蛋白质的分析

     MCAC可用于糖基化和磷酸化(糖基化和磷酸化的会改变蛋白对金属离子的结合能力)分析和研究蛋白质的相互作用。

 

3.用于蛋白质的复性

       变性蛋白质能吸附在固相介质上,控制变性剂除去的速度,蛋白质可以逐步折叠复性,MCAC可避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。

 

4.其他领域的应用

 过渡金属亲和吸附蛋白的特性也成功应用在生物传感器和蛋白质芯片领域。

固定化金属螯合亲和层析方法的选择和建立

由于蛋白质表面的氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,导致蛋白质与过渡金属的结合能力的不同,因而需根据具体情况选择最优的层析介质和过渡金属。常见的MCAC介质及其性能参数见下表(表1)。

表1:常见的MCAC介质及其性能参数

图1:MCAC介质结构示意图

图2a:IDA/NTA/IMAC介质的清洗方式

图2b:TED/EXCEL介质的清洗方式

 

原核表达His标签蛋白的纯化工艺

可溶蛋白纯化工艺流程 

  

包涵体纯化工艺流程

 

真核表达His标签蛋白的纯化工艺

纯化工艺流程一(Ni-IDA/Ni-NTA/Ni-IMAC)

 

 

***:缓冲液置换方法及其优劣对比分析


方法

缓冲液用量

周期

适用规模

回收率

透析

20-40倍样品体积

16h

实验室

70%

超滤

9-15倍样品体积

3h

不限

90%

凝胶过滤

2-4倍样品体积

1h

不限

95%


纯化工艺流程二(Ni-TED)

发展趋势

鉴于生产的高效性、经济性和目标蛋白特定需要,快速、高效的金属螯合层析介质将逐步取代传统介质。

本文中书写浅入浅出,如有纰漏之处还望各位读者批评指证。由于大分子物质的多样性和结构的复杂性,生产和实践操作中会遇到众多异常和难以诠释之处,欢迎大家沟通交流。

参考文献

1.魏琪,鲍时翔,姚汝华. 固定化金属螯合亲和层析技术研究进展

2.景志刚,杨春瑜,杨春莉,刘海玲. 固定化金属螯合亲和层析介质及其应用研究进展

3.王红艳,朱建星,张万忠. 金属螯合亲和层析介质及应用研究的进展