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小鼠单个核细胞分离一步梯度法去除死细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  基本原理

  活细胞(密度较小)和死细胞(密度较大)密度不同,从而有助于将活的淋巴细胞和红细胞分离。

  附加材料

  高密度溶液:Ficoll-Paque(Ficoll和泛影酸钠;Pharmacia LKB)或Lympholyte-M(Cedarlane)

  12ml或50ml聚丙烯离心管(比聚苯乙烯离心管好)

  注: Ficoll-Paque和Lympholyte-M的密度与温度有关;该方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液适合在室温中使用。因此应注意使细胞悬液、离心和高密度溶液控制在室温。否则会因活细胞沉入离心管底导致在密度界面上损失活细胞。

  实验方案

  1、用RPMI-5完全培养基混悬细胞,分装到离心管中使其细胞数达到0.5×108 ~1×108个细胞/2ml(12ml离心管)或1×108 ~5×108 个细胞/5ml(50ml离心管)。

  2、用移液器吸取3ml(使用12ml离心管时)或5ml(使用50ml离心管时)高密度溶液,将枪头伸到离心管底,缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方。

  3、室温,800g离心15min。为了取得好的分离效果,最好将离心机的“brake”开关关掉。

  4、使用5ml移液器,沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头,吸入漂浮在高密度层上方的活细胞,尽量少收集高密度溶液。将活细胞移入另一管中。

  5、加入RPMI-5完全培养基(少量细胞加入10ml,细胞量较多时加入40ml),室温,200g离心10min。重复一次。

  6、以适量培养基混悬细胞以便进行下一步操作。